что такое световой микроскоп в биологии
Световые микроскопы и их виды
Световой микроскоп – это оптический прибор, позволяющий получить увеличенное изображение трудноразличимых невооруженным глазом или вообще невидимых объектов (либо деталей их структуры). В общем случае микроскоп состоит из штатива, предметного столика и подвижного тубуса с окуляром и объективом. Современные приборы оснащаются также специальной осветительной системой.
Микроскопы широко используются в самых разных отраслях промышленности, в области образования и науки, для проведения экспертиз. В зависимости от своего предназначения и конструктивных особенностей световые микроскопы подразделяются на металлографические, биологические, криминалистические, люминесцентные, поляризационные, инвертированные, стереомикроскопы и моновидеомикроскопы.
Биологические микроскопы
Наиболее знакомы обывателю биологические микроскопы. Их также называют лабораторными, медицинскими, микроскопами проходящего света и плоского поля. Их предназначение – изучение прозрачных и полупрозрачных объектов. Лабораторные микроскопы особенно широко применяются в различных областях биологии (ботанике, микробиологии, цитологии) и медицины, а также – в археологии, микроэлектронике, пищевой промышленности, геологии и т. д. Подобные устройства могут оснащаться или дополнительно комплектоваться специальными аксессуарами, насадками, светофильтрами, наборами объективов и окуляров, цифровыми фото- и видеокамерами.
Люминесцентные микроскопы
При работе люминесцентных микроскопов используются свойства флюоресцентного излучения, то есть способность некоторых объектов и красителей испускать свечение при облучении их ультрафиолетом или другими коротковолновыми лучами света.
Люминесцентный микроскоп снабжен мощным источником освещения с большой поверхностной яркостью, максимум излучения которого находится в коротковолновой области видимого спектра, системой светофильтров, а также интерференционной светоделительной пластинкой, применяемой при возбуждении люминесценции падающим светом. В современных люминесцентных микроскопах применяются специальные флюоресцирующие или ферментные метки, за счет чего удалось существенно уменьшить размеры оборудования. Подобные приборы особенно эффективны при исследованиях крови, клеток костного мозга, антигенных анализах.
Стереомикроскопы
Стереомикроскопы позволяют получать объемное изображение исследуемого объекта за счет наличия у него не одного, а сразу двух объективов, расположенных под углом. Стереомикроскопы обладают существенно большей глубиной резкости по сравнению с обычными микроскопами плоского поля. За счет наличия таких свойств подобные устройства могут эффективно использоваться в ряде областей промышленности, к примеру – в ювелирном деле. Помимо стандартных стереомикроскопов, получили распространение и цифровые модели.
Криминалистические микроскопы
Криминалистические микроскопы предназначены для одновременного сравнительного анализа двух объектов. Подобные экспертизы позволяют выявить идентичность таких предметов, как волосы, гильзы, пули, волокна, нитки, ткани и пр. Для исключения возможных ошибок сегодня широко применяется дополнительное цифровое оборудование и программное обеспечение. Криминалистические микроскопы могут использоваться в комплексе с фото- и видеокамерами и персональными компьютерами.
Металлографические микроскопы
Металлографические микроскопы предназначены для изучения структуры поверхности непрозрачных материалов, в первую очередь металлов и сплавов. Подобные исследования производятся в отраженном свете. Для получения желаемого эффекта используются специальные системы линз и зеркал. Металлографические микроскопы по своей конструкции могут быть прямыми или инвертированными, а также портативными. Наиболее эффективными являются современные цифровые модели, позволяющие производить максимально точные исследования поверхности изучаемых объектов. Подобные приборы применяются в металлургии, машиностроении, археологии, геологии и т.д.
Поляризационные микроскопы
Поляризационные микроскопы относятся к наиболее сложным в технологическом плане типам оптического оборудования. Они используются для исследования материалов, обладающих нестандартными (анизотропными) оптико-кристаллическими свойствами. В процессе работы формируется поляризованный световой поток, который облучает изучаемый образец. Поляризованные микроскопы наиболее широко применяются в минералогии, кристаллографии, петрографии, а также при проведении гематологических, гистологических и других медицинских и микробиологических исследований.
Инвертированные микроскопы
Инвертированные микроскопы отличаются тем, что их объективы находятся под исследуемым предметом. Это позволяет работать с достаточно большими по своему объему объектами, а также использовать специальную лабораторную посуду и инструменты. При этом инвертированные микроскопы могут быть биологическими, люминесцентными, металлографическими и пр. Подобные приборы широко используются при различных научных и лабораторных исследованиях в микробиологии, медицине, машиностроении, микроэлектронике и т.д.
Моновидеомикроскопы
Моновидеомикроскопы предназначены для получения видеоизображения наблюдаемых объектов с возможностью вывода на экран, записи и последующего анализа информации. При этом конструктивно устройство является объективом для камеры. Для эффективной работы моновидеомикроскопы можно дополнительно комплектовать необходимыми аксессуарами (предметными столами, линзами, фильтрами, осветителями, адаптерами).
Световой микроскоп
Микроско́п (от греч. μικρός — малый и σκοπεῖν — смотрю) — оптический прибор для получения увеличенных изображений объектов (или деталей их структуры), невидимых невооружённым глазом.
Содержание
История микроскопа
Невозможно точно определить, кто изобрёл микроскоп. Считается, что голландский мастер очков Ханс Янссен и его сын Захария Янссен изобрели первый микроскоп в 1590, но это было заявление самого Захария Янссена в середине XVII века. Дата, конечно, не точна, так как оказалось, что Захария родился около 1590 г. Другим претендентом на звание изобретателя микроскопа был Галилео Галилей. Он разработал «occhiolino» («оккиолино»), или составной микроскоп с выпуклой и вогнутой линзами в 1609 г. Галилей представил свой микроскоп публике в Академии деи Линчеи, основанной Федерико Чези в 1603 г. Изображение трёх пчел Франческо Стеллути было частью печати Папы Урбана VIII и считается первым опубликованным микроскопическим символом (см. «Stephen Jay Gould, The Lying stones of Marrakech, 2000»). Кристиан Гюйгенс, другой голландец, изобрел простую двулинзовую систему окуляров в конце 1600-х, которая ахроматически регулировалась и, следовательно, стала огромным шагом вперед в истории развития микроскопов. Окуляры Гюйгенса производятся и по сей день, но им не хватает широты поля обзора, а расположение окуляров неудобно для глаз по сравнению с современными широкообзорными окулярами. Антон Ван Левенгук (1632—1723) считается первым, кто сумел привлечь к микроскопу внимание биологов, несмотря на то, что простые увеличительные линзы уже производились с 1500-х годов, а увеличительные свойства наполненных водой стеклянных сосудов упоминались ещё древними римлянами (Сенека). Изготовленные вручную, микроскопы Ван Левенгука представляли собой очень небольшие изделия с одной очень сильной линзой. Они были неудобны в использовании, однако позволяли очень детально рассматривать изображения лишь из-за того, что не перенимали недостатков составного микроскопа (несколько линз такого микроскопа удваивали дефекты изображения). Понадобилось около 150 лет развития оптики, чтобы составной микроскоп смог давать такое же качество изображения, как простые микроскопы Левенгука. Так что, хотя Антон Ван Левенгук был великим мастером микроскопа, он не был его изобретателем вопреки широко распространённому мнению.
Недавние достижения
Немецкие ученые Штефан Хелль в 2006 году Stefan Hell и Мариано Босси Mariano Bossi из Института биофизической химии разработали оптический микроскоп под названием Наноскоп, позволяющий наблюдать объекты размером около 10 нм и получать высококачественные трёхмерные изображения. [1]
Применение
Человеческий глаз представляет собой биологическую оптическую систему, характеризующуюся определённым разрешением, т. е. наименьшим расстоянием между элементами наблюдаемого объекта (воспринимаемыми как точки или линии), при котором они ещё могут быть отличены один от другого. Для нормального глаза при удалении от объекта на т. н. расстояние наилучшего видения (D = 250 мм), среднестатистическое нормальное разрешение составляет 0,176 мм. Размеры микроорганизмов, большинства растительных и животных клеток, мелких кристаллов, деталей микроструктуры металлов и сплавов и т. п. значительно меньше этой величины. Для наблюдения и изучения подобных объектов и предназначены микроскопы различных типов. С помощью микроскопов определяли форму, размеры, строение и многие другие характеристики микрообъектов. Оптический микроскоп в видимом свете давал возможность различать структуры с расстоянием между элементами до 0,20 мкм. Так было до создания оптического микроскопа наноскопа. [2]
Устройство микроскопа
Оптическая система микроскопа состоит из основных элементов — объектива и окуляра. Они закреплены в подвижном тубусе, расположенном на металлическом основании, на котором имеется предметный столик.
В современном микроскопе практически всегда есть осветительная система (в частности, конденсор с ирисовой диафрагмой), макро- и микро- винты для настройки резкости, система управления положением конденсора.
В зависимости от назначения, в специализированных микроскопах могут быть использованы дополнительные устройства и системы.
Объективы
Иммерсия
Может быть сухой и масляной. а)сухая: показатель преломления равен 1; б)масляная: используется при работе с мелкими объектами, показатель преломления равен 1,33 Иммерсионное масло добывают из деревьев
Окуляры
Система освещения препарата
В первых микроскопах исследователи вынуждены были пользоваться естественными источниками света. Для улучшения освещённости стали использовать зеркало, а затем — и вогнутое зеркало, с помощью которого на препарат направляли лучи солнца или лампы. В современных микроскопах освещение регулируют с помощью конденсора.
Конденсор
Конденсор (от лат. condense — сгущаю, уплотняю), короткофокусная линза или система линз, используемая в оптическом приборе для освещения рассматриваемого или проецируемого предмета. Конденсор собирает и направляет на предмет лучи от источника света, в том числе и такие, которые в его отсутствие проходят мимо предмета; в результате такого «сгущения» светового потока резко возрастает освещённость предмета. Конденсоры применяются в микроскопах, в спектральных приборах, в проекционных аппаратах различных типов (например, диаскопах, эпидиаскопах, фотографических увеличителях и т. д.). Конструкция конденсора тем сложнее, чем больше его апертура. При числовых апертурах до 0,1 применяют простые линзы; при апертурах 0,2—0,3— двухлинзовые конденсоры, выше 0,3—трёхлинзовые. Наиболее распространён конденсор из двух одинаковых плосковыпуклых линз, которые обращены друг к другу сферическими поверхностями для уменьшения сферической аберрации. Иногда поверхности линз конденсора имеют более сложную форму — параболоидальную, эллипсоидальную и т. д. Разрешающая способность микроскопа повышается с увеличением апертуры его конденсора, поэтому конденсоры микроскопов — обычно сложные двух или трёхлинзовые системы. В микроскопах и кинопроекционных аппаратах широко применяют также зеркальные и зеркально-линзовые конденсоры, апертура которых может быть очень велика — угол 2u раствора собираемого пучка лучей достигает 240°. Часто наличие в конденсорах нескольких линз вызвано не только стремлением увеличить его апертуру, но и необходимостью однородного освещения предмета при неоднородной структуре источника света. [3]
Конденсор тёмного поля
Предметный столик
Предметный столик выполняет роль поверхности, на которой размещают микроскопический препарат. В разных конструкциях микроскопов столик может обеспечить координатное движение препарата в поле зрения объектива, по вертикали и горизонтали, или поворот препарата на заданный угол.
Вспомогательные приспособления
Предметные и покровные стёкла
Первые наблюдения в микроскоп производились непосредственно над каким-либо объектом (птичье перо, снежинки, кристаллы и т. п.). Для удобства наблюдения в проходящем свете, препарат стали размещать на стеклянной пластинке (предметное стекло). Иногда эту пластинку делали с лункой — для размещения объекта в капле воды. Позже препарат стали закреплять тонким покровным стеклом, что позволило создавать коллекции образцов, например, гистологические коллекции.
Классификация
Рабочие лабораторные микроскопы
Бинокулярные микроскопы
Бинокулярный микроскоп (иначе — стереомикроскоп) позволяет получать 2 изображения объекта, рассматриваемые под небольшим углом, что обеспечивает объёмное восприятие. В современных бинокулярных микроскопах одновременно используются два окуляра (по одному на каждый глаз) и обычно 1 объектив. Общее увеличение (объектив*оккуляр) бинокуляров обычно меньше, чем у монокулярных микроскопов. Бинокулярные микроскопы хорошо работают как в проходящем, так и в отражённом свете.. [4]
Наиболее широко бинокуляры используются для исследования неоднородностей поверхности твёрдых непрозрачных тел, таких как горные породы, металлы, ткани; в микрохирургии и пр.
Металлографические микроскопы
Специфика металлографического исследования заключается в необходимости наблюдать структуру поверхности непрозрачных тел. Поэтому микроскоп построен по схеме отраженного света, где имеется специальный осветитель установленный со стороны объектива. Система призм и зеркал направляет свет в объектив, далее свет отражается от не прозрачного объекта и направляется обратно в объектив. «.. [5]
Световая микроскопия это: краткое описание метода
Световая микроскопия
В основе световой микроскопии лежат различные свойства света. Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма.
Современные световые микроскопы представляют собой довольно сложные приборы, совершенствующиеся в течение 400 лет с момента создания первого прототипа микроскопа.
Освещение при микроскопии играет весьма существенную роль.
Неправильное или недостаточное освещение не позволит использовать полностью все возможности микроскопа.
Закрыв диафрагму осветителя, открывают диафрагму конденсора и, перемещая конденсор, добиваются резкого изображения диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа. Чтобы яркий свет не слепил глаза, предварительно уменьшают с помощью реостата накал нити лампы.
И, наконец, с помощью зеркала изображение отверстия диафрагмы устанавливают в центре поля зрения, а диафрагму осветителя открывают так, чтобы было освещено все видимое поле зрения. Раскрывать больше диафрагму не нужно, так как это не усилит освещенности, а лишь уменьшит контрастность за счет рассеянного света.
Виды световой микроскопии
Люминесцентная микроскопия
Люминесцентная микроскопия — метод наблюдения под микроскопом люминесцентного свечения микрообъектов при освещении их сине-фиолетовым светом или ультрафиолетовыми лучами
Метод основан на способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых лучей света.
При этом длина волны излучаемого при люминесценции света всегда будет больше, чем длина волны света, возбуждаемого люминесценцию. Так, если освещать объект синим светом, он будет испускать лучи красного, оранжевого, желтого и зеленого цвета.
Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специальными светящимися люминесцентными красителями – флуохромами (акридиновый оранжевый, изотиоционат флуоресцеина и др.).
Лучи света от сильного источника (обычно ртутной лампы сверхвысокого давления) пропускают через сине-фиолетовый светофильтр. Под действием этого коротковолнового излучения окрашенные флуохромом клетки или бактерии начинают светиться красным или зеленым светом.
Для того, чтобы синий свет, вызвавший люминесценцию, не мешал наблюдению, над окуляром ставят запирающий желтый светофильтр, задерживающий синие, но пропускающий желтые, красные и зеленые лучи.
В результате при наблюдении в люминесцентном микроскопе на темном фоне видны будут клетки или бактерии, светящиеся желтым, зеленым или красным цветом. Например, при окраске акридиновым оранжевым ДНК клетки (ядерное вещество) будет светиться ярко-зеленым цветом.
Метод люминесцентной микроскопии позволяет изучать живые нефиксированные бактерии, окрашенные сильно разведенными флуохромами, не причиняющими вреда миробным клеткам.
По характеру свечения могут быть дифференцированы отдельные химические вещества, входящие в состав микробной клетки.
Темнопольная микроскопия
При микроскопии по методу темного поля препарат освещается сбоку косыми пучками лучей, не попадающими в объектив.
В обектив попадают лишь лучи, которые отклоняются частицами препарата в результате отражения, преломления или дифракции. В силу этого микробные клетки и другие частицы представляются ярко светящимися на черном фоне (картина напоминает мерцающее звездное небо).
Для микроскопии в темном поле используют специальный конденсор (параболоид-конденсор или кардиоид-конденсор) и обычные объективы.
Так как аппаратура иммерсионного объектива больше, чем апертура конденсора темного поля, внутрь иммерсионного объектива вставляется специальная трубчатая диафрагма, снижающая его апертуру.
Этот метод микроскопии удобен при изучении живых бактерий, спирохет и их подвижности.
Фазово-контрастная микроскопия
Обыкновенные окрашенные препараты поглощают часть проходящего через них света, в результате чего амплитуда световых волн снижается, и частицы препарата выглядят темнее фона.
При прохождении света через неокрашенный препарат амплитуда световых волн не меняется, происходит лишь изменение фазы световых волн, прошедших через частицы препарата. Однако человеческий глаз улавливать это изменение фазы света не способен, поэтому неокрашенный препарат при правильной установке освещения в микроскопе будет невидим.
Фазово-контрастное устройство позволяет превратить изменение фазы лучей, прошедших через частицы неокрашенного препарата, в изменения амплитуды, воспринимаемые человеческим глазом, и, таким образом, позволяет сделать неокрашенные препараты отчетливо видимыми.
Приспособление для фазово-контрастной микроскопии включает в себя конденсор с набором кольцевых диафрагм, обеспечивающих освещение препарата полным конусом света, и фазово-контрастные объективы, которые отличаются от обычных тем, что в их главном фокусе располагается полупрозрачная фазовая пластинка в виде кольца, вызывающая сдвиг фазы проходящего через нее света.
Установку освещения проводят так, чтобы весь свет, прошедший через кольцевидную диафрагму конденсора, в дальнейшем прошел через расположенное в объективе фазовое кольцо.
При рассмотрении препарата весь свет, прошедший через участки препарата в которых нет каких-либо объектов, пройдет через фазовое кольцо и даст светлое изображение фона. Свет, прошедший через имеющиеся в препарате частицы, например, бактериальные клетки, получит некоторое изменение фазы и, кроме того, разделится на два луча – недифрагированный и дифрагированный.
Недифрагированные лучи, пройдя в дальнейшем через кольцевидную фазовую пластинку в объективе, получат дополнительный сдвиг фазы.
Дифрагированные лучи пройдут мимо фазовой пластинки, и их фаза не изменится. В плоскости полевой диафрагмы окуляра произойдет интерференция (наложение) дифрагированного и недифрагированного лучей, а так как эти лучи идут в разных фазах, произойдет их взаимное частичное гашение и уменьшение амплитуды.
Благодаря этому микробные клетки будут выглядеть темными на светлом фоне.
Существенными недостатками фазово-контрастной микроскопии являются слабая контрастность получаемых изображений и наличие светящихся ореолов вокруг объектов.
Фазово-контрастная микроскопия не увеличивает разрешающей способности микроскопа, но помогает выявить детали структуры живых бактерий, стадии их развития, изменения в них под действием различных агентов (антибиотики, химические вещества и т.д.).
Электронная микроскопия
Для изучения структуры клеток на субклеточном и молекулярном уровнях, а также для изучения вирусов используют электронную микроскопию.
Ценность электронной микроскопии заключается в ее способности разрешать объекты, не разрешаемые оптическом микроскопом в видимом или ультрафиолетовом свете.
Малая длина волны электронов, которая уменьшается в прямой зависимости от подаваемого ускоряющего напряжения, позволяет разрешать, т.е. различать как отдельные объекты, отстоящие друг от друга всего на 2А (0,2 нм или 0,0002 мкм) или даже меньше, в то время как предел разрешения световой оптики лежит вблизи 0,2 мкм (он зависит от длины волны используемого света).
Электронная микроскопия, при которой изображение получают благодаря прохождению (просвечиванию) электронов через образец, называется просвечивающей (трансмиссивной).
При сканирующей (растровой), или туннельной электронной микроскопии пучок электронов быстро сканирует поверхность образца, вызывая излучение, которое посредством катодно-лучевой трубки формирует изображение на светящемся экране микроскопа по аналогии с формированием телевизионного изображения.
Принципиальная оптическая схема электронного микроскопа аналогична схеме светового, в котором все оптическое элементы заменены соответствующими электрическими: источник света – источником электронов, стеклянные линзы – линзами электромагнитными.
Электронные микроскопы: системы
В электронных микроскопах просвечивающего типа различают три системы: электронно-оптическую, вакуумную и электропитания.
Источником электронов является электронная пушка, состоящая из V-образного вольфрамового термокатода, который при нагревании до 2900°С при подаче постоянного напряжения до 100 кВ в результате термоэмиссии испускает свободные электроны, ускоряемые затем электростатическим полем, создаваемым между фокусирующим электродом и анодом.
Электронный пучок затем формируется с помощью конденсорных линз и направляется на исследуемый объект. Электроны, проходя сквозь объект, за счет его разной толщины и электроплотности отклоняются под различными углами и попадают в объективную линзу, которая формирует первое увеличение объекта.
После объективной линзы электроны попадают в промежуточную линзу, которая предназначена для плавного изменения увеличения микроскопа и получения дифракции с участков исследуемого образца.
Проекционная линза создает конечное увеличенное изображение объекта, которое направляется на флуоресцентный экран.
Благодаря взаимодействию быстрых электронов с люминофором экрана на нем возникает видимое изображение объекта. После наведения резкости сразу проводят фотографирование.
Увеличение конечного изображения на экране определяется как произведение увеличений, даваемых объективной, промежуточной и проекционной линзами.
Электронномикроскопическому исследованию могут быть подвергнуты как ультратонкие срезы различных тканей, клеток, микроорганизмов, так и целые бактериальные клетки, вирусы, фаги, а также субклеточные культуры, выделяемые при разрушении клеток различными способами.
Виды электронных микроскопов
1) Просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ) — это установка, в которой изображение от ультратонкого объекта (толщиной порядка 0,1 мкм) формируется в результате взаимодействия пучка электронов с веществом образца с последующим увеличением магнитными линзами (объектив) и регистрацией на флуоресцентном экране.
Для регистрации изображения возможно использование сенсоров, например, ПЗС-матрицы. Первый практический просвечивающий электронный микроскоп был построен Альбертом Пребусом и Дж. Хиллиером в университете Торонто (Канада) в 1938 году с использованием концепции, предложенной ранее Максом Кноллом и Эрнстом Руска.
2) Растровый электронный микроскоп (РЭМ, англ. Scanning Electron Microscope, SEM) — прибор, позволяющий получать изображения поверхности образца с большим разрешением (несколько нанометров).
Ряд дополнительных методов позволяет получать информацию о химическом составе приповерхностных слоёв;
3) Сканирующий туннельный микроскоп (СТМ, англ.STM — scanning tunneling microscope) — прибор, предназначенный для измерения рельефа проводящих поверхностей с высоким пространственным разрешением. В СТМ острая металлическая игла подводится к образцу на расстояние нескольких ангстрем.
При подаче на иглу относительно образца небольшого потенциала возникает туннельный ток. Величина этого тока экспоненциально зависит от расстояния образец-игла. Типичные значения 1-1000 пА при расстояниях около 1 Å.
Современные модели электронных микроскопов устроены так, что сочетают в себе возможности как просвечивающего, так и сканирующего микроскопов, и их легко можно переоборудовать с одного типа на другой.
Просвечивающая электронная микроскопия применяется для изучения ультратонких срезов микробов, тканей, а также строения мелких объектов (вирусов, жгутиков и др.), контрастированных фосфорно-вольфрамовой кислотой, уранилацетатом, напылением металлов в вакууме.
Сканирующая электронная микроскопия применяется для изучения поверхности объектов. При просвечивающей электронной микроскопии получают плоскостные изображения объекта, а при сканирующей – удается получить трехмерное объемное изображение. В бактериологии сканирование наиболее эффективно для выявления отростков и других поверхностных структур, для определения формы и топографических отношений как в колониях, так и на поверхности инфицированных тканей.
При сканирующей микроскопии образец фиксируют, высушивают на холоде и напыляют в вакууме золотом или другими тяжелыми металлами.
Таким образом получают реплику (отпечаток), повторяющую контуры образца, впоследствии сканируемую.
Недостатки электронного микроскопа
Световая микроскопия. В основе световой микроскопии лежат различные свойства света. Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма.
Современные световые микроскопы представляют собой довольно сложные приборы, совершенствующиеся в течение 400 лет с момента создания первого прототипа микроскопа.
Освещение при микроскопии играет весьма существенную роль. Неправильное или недостаточное освещение не позволит использовать полностью все возможности микроскопа.
Хорошее освещение достигается при установке света по методу Келлера.
Закрыв диафрагму осветителя, открывают диафрагму конденсора и, перемещая конденсор, добиваются резкого изображения диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа.
Чтобы яркий свет не слепил глаза, предварительно уменьшают с помощью реостата накал нити лампы. И, наконец, с помощью зеркала изображение отверстия диафрагмы устанавливают в центре поля зрения, а диафрагму осветителя открывают так, чтобы было освещено все видимое поле зрения. Раскрывать больше диафрагму не нужно, так как это не усилит освещенности, а лишь уменьшит контрастность за счет рассеянного света.