что такое секвестирование днк

Что такое секвестирование днк

Сегодня много пациентов страдает от неверного диагноза или несвоевременно обнаруженного заболевания, связанного с нарушениями в структуре ДНК.

Распространенные генетические тесты, такие как анализ одного гена, панели из нескольких генов или микроматричный анализ, часто не могут до конца выявить точную причину болезни из-за своих ограниченных возможностей.

Недавние достижения молекулярной генетики позволили сделать доступным по цене и скорости выполнения новый метод генетического тестирования — полногеномное секвенирование.

Полное секвенирование генома способно обнаружить почти все изменения в ДНК пациента, расшифровывая последовательность всех кодирующих и некодирующих областей. Результат такого исследования — информация о тысячах генов, участвующих в нормальном росте и развитии организма.

Этот метод с успехом заменяет все ранее известные способы генетического тестирования, соединяя в себе их возможности. С каждым годом он позволяет установить точный диагноз все большего числа заболеваний.

Используя полногеномное секвенирование, лечащий врач получает помощь не только в диагностике, но и более точно принимает решения по лечению, может наблюдать за течением заболевания, делать прогноз развития болезни и выздоровления. Точные рекомендации о прогрессировании заболевания также возможны в некоторых случаях.

По результатам тестирования может быть проведена оценка риска наследственных заболеваний для других членов семьи.

Полное секвенирование может быть проведено по направлению лечащего врача, а также по желанию пациента без наличия срочных медицинских показаний.

Структура генома не изменяется в течение всей жизни. Сделав анализ однократно, его результатами можно пользоваться всю жизнь. К ним можно повторно обращаться при появлении очередных открытий в генетике и с учетом новых знаний более точно интерпретировать данные.

Имея на руках готовую расшифровку своего генотипа, человек подготовит себя к возможным экстренным ситуациям, когда подробная генетическая информация может спасти жизнь — травмы, операции, тяжелые заболевания, пересадка органов и другие.

Полногеномное секвенирование — лучший на сегодня метод продолжать исследование структуры ДНК, функций генов, их влияния друг на друга и на проявления фенотипа.

Хотя крупные исследовательские центры в мире ведут эту работу, ее результаты не всегда широко доступны.

Поэтому многие исследователи делают это самостоятельно для своих узкоспециализированных целей — подбор и разработка препаратов, спортивные достижения, селекция растений и животных, диагностика и лечение болезней.

Лаборатория «Геномед», обладая современным оборудованием, проверенными технологиями и квалифицированными специалистами-генетиками, готова предоставлять эти ресурсы для целого ряда научных разработок.

Фундаментальные исследования

Изучение структуры и функции генома

Исследование генома человека не завершено до сих пор. Полногеномное сенквенирование дает новые возможности поиска нераскрытых функций генов, изучения некодирующих областей и регуляторных участков ДНК.

Структурные изменения и CNV

В отличие от большинства других генетических методов полногеномное секвенирование позволяет точно определять любые изменения структуры ДНК.

Часто достигается точность определения до уровня единичного нуклеотида. Поэтому, если требуется достоверно определить транслокации, инверсии, вставки или делеции участков, стоит использовать тест Genome UNI.

Эпигенетика

После создания технологии полногеномного секвенирования появилась возможность изучать закономерности наследования, не связанные с генетической последовательностью. В первую очередь речь идет о механизмах регуляции экспрессии генов.

В вопросах эпигенетики важную роль играют методики исследования метилирования ДНК (MeDIP-Seq, WGBS), взаимодействия и модификации гистонов (ChlP-Seq), метилирования РНК (TRM).

Полногеномные ассоциативные исследования

Исследование связи между структурой генома и фенотипическими признаками позволяет выявить, как проявляются различные сочетания генов.

Результат такой работы — более четкое понимание механизмов развития полигенных и многофакторных заболеваний, выявление влияния гетерозиготности на развитие признаков и оценка влияния средовых факторов.

Митохондриальный геном

В отличие от других генетических тестов полногеномное секвенирование исследует одновременно весь генетический материал клетки — ДНК ядра и ДНК митохондрий. Это особенно важно при изучении наследственности по материнской линии и обнаружении наследственных митохондриальных заболеваний.

Транскриптом

Полногеномное секвенирование позволяет оценивать не только геном клетки, но и ее транскриптом — совокупность всех типов РНК.

Важность транскриптома в том, что он показывает активность экспрессии определенных генов на текущий момент. Эта активность сильно зависит от состояния окружающей среды и самого организма и может говорить о наличии неблагоприятных процессов.

Биоинформатический анализ

Расширенный пайплайн

Многопотоковое секвенирование позволяет одновременно проводить расшифровку множества участков одной ДНК. Это значительно ускоряет процесс чтения, позволяет снизить стоимость и добиться высокой точности.

В настоящее время полногеномный анализ покрывает больше 96% генов с глубиной прочтения >20х, а время исследования одного генома сократилось до 1 суток.

Платформа управления данными

Результаты анализов представлены в виде удобного пользовательского интерфейса в личном кабинете. Там же доступны данные интерпретации, если она проводилась, и полученные рекомендации.

Владелец доступа может в любое время обратиться к своим результатам или загрузить их для off-line использования.

Пользовательский биоинформационный сервис

Кроме оборудования и передовых технологий «Геномед» рад предоставить консультационные услуги опытных врачей-генетиков.

Направляя пациента на анализ, вы получите не только расшифровку нуклеотидной последовательности, но и, при необходимости, ее клиническую интерпретацию и рекомендации по использованию результатов.

Собственное хранилище данных

Данные о проведенных исследованиях хранятся на собственных серверах лаборатории.

Все данные шифруются и доступ к ним предоставляется исключительно заказчику с индивидуальным логином и паролем.

Прикладные исследования

Диагностика генетических заболеваний

Сегодня насчитывают около 6000 различных генетических заболеваний и нарушений. Многие из них обладают схожими симптомами, но вызваны патологией разных генов. Если искать эти заболевания по отдельности, потребуется огромное количество исследований.

Полногеномное секвенирование позволяет заменить все виды генетических и многих лабораторных исследований единственным точным и высокоинформативным тестом.

Геном опухоли

Полногеномное секвенирование опухоли дает ключ к пониманию канцерогенеза. Это не только определение основных мутаций, приводящих к развитию рака.

Получив полную расшифровку генома, онколог может оценить уровень сопротивляемости организма росту опухоли, следить за изменением опухоли под воздействием терапии, подбирать наиболее эффективные и безопасные сочетания препаратов.

Профилактическое здоровье

Данные об индивидуальных предрасположенностях к заболеваниям могут изменить образ жизни человека.

На этом основании проще подобрать диету, нагрузки, препятствовать или способствовать воздействию различных факторов внешней среды.

Это позволит не просто увеличить продолжительность жизни, но и улучшить ее качество.

Создание лекарств

Данные об индивидуальных предрасположенностях к заболеваниям могут изменить образ жизни человека.

В зависимости от своего генетического статуса человек по разному реагирует на лекарственную терапию. Гены влияют как на эффективность, так и на переносимость препаратов. Полногеномное тестирование позволяет решать две важные задачи фармакотерапии.

Первая задача — поиск биомаркеров заболеваний. Наглядный пример — простатоспецифический антиген, используемый для диагностики опухолей предстательной железы.

Вторая задача — персонализация лекарственной терапии. В идеале препарат должен разрабатываться для генотипически близких групп пациентов или даже индивидуально с учетом конкретного набора генов.

Судебная медицина / Судебная патология

Генетические данные сегодня широко используются в криминалистической и судебной практике. Ниже перечислены некоторые примеры такого применения. Определение родства\материнства\отцовства.

Антропология и этнос

Изучение ДНК предков или представителей различных этнических групп позволяет понимать историю происхождения и развития человека и законы передачи наследственной информации.

Для отдельного человека появляется возможность разобраться в своих корнях и родословной. Для общества и науки — это источник изучения этнических особенностей здоровья, заболеваемости, долголетия и возможностей развития.

Диагностика наследственных заболеваний

Анализ всего генома в одном исследовании чаще всего приводит к более быстрой постановке диагноза генетического состояния по сравнению с многочисленными сериями одиночных генетических тестов. Особенно это справедливо, если клиническая картина не дает генетику четких указаний, в каких локализациях следует искать патологию, либо тогда, когда клиника может быть обусловлена патологией разных или нескольких генов.

Репродуктивное здоровье

Четко определена связь ряда генов с репродуктивной функцией. Мужское и женское бесплодие, невынашивание, хромосомные болезни новорожденных — все эти состояния можно обнаружить, а впоследствии и успешно лечить, если знать состояние генов, ответственных за процессы зачатия и развития плода.

Онкология

Молекулярно-генетические исследования — мощный инструмент в борьбе с онкологическими заболеваниями.

Во-первых, расшифровав полный геном, можно оценить не только гены, напрямую связанные с развитием рака. Одновременно врач получает полную картину состояния антиоксидантной защиты, противоопухолевого иммунитета, антитоксической функции и других систем, которые косвенно влияют на появление и течение онкопроцесса.

Во-вторых, генетические методы позволяют более эффективно подобрать препарат, контролировать процесс лечения и склонность к рецидивированию.

Важно, что полногеномное исследование (WGS) экономически намного выгоднее, чем исследование отдельных генов или серии генетических панелей (наборов анализов генов, связанных с определенной патологией).

Сегодня с помощью полногеномного тестирования можно оценить 649 опухолевых генов и еще 28 генов, способных нести хромосомные транслокации (перенос участков ДНК между хромосомами), связанные с развитием рака.

Планирование семьи

Известно, что предрасположенность к заболеваниям передается по наследству. Существует группа заболеваний, которые зависят от состояния генов и носят название аутосомно-рецессивных.

Полногеномное секвенирование способно показать людям, вступающим в брак, риски рождения у них детей с аутосомно-рецессивными болезнями.

Предрасположенность к заболеваниям

Почему одни люди заболевают раком, а другие нет? Кто-то живет до 100 лет, многие же умирают в молодости. Как узнать причину?

Сегодня уже четко установлена связь многих генов с развитием заболеваний. Причем, состояние одних генов улучшает прогноз, других — ухудшает. Примеры таких болезней — атеросклероз, остеопороз, тромбозы.

Если знать сочетание всех генов, можно рассчитывать риск развития заболеваний для человека, даже если он пока абсолютно здоров, а также предотвращать их появление.

Индивидуальные способности

Для многих способностей и склонностей человека показана прямая зависимость от состояния его генотипа. К ним относятся мышечная выносливость и сила, темперамент, наклонность к разного рода зависимостям и многое другое. Если планировать профессию и образ жизни на основании генетического анализа, можно достигать лучших результатов быстрее и с меньшими усилиями.

Почему нужно использовать
секвенирование генома

Полногеномное тестирование обладает целым рядом преимуществперед другими методами
в скорости, широте и точности расшифровки генетической последовательности
и установлении диагноза.

Информация для исследователей

Фундаментальные исследования

Секвенирование и ресеквенирование генома, анализ метагенома, экспрессии и метилирования генов.

Прикладные исследования

Поиск биомаркеров, рекрутинг пациентов, решения для селекции.

Медицинские исследования

Секвенирование генома и экзома, анализ на микрочипах.

Биоинформатический анализ

Расширенный пайплайн, биоинформационный сервис, платформа управления данными, хранилище данных.

Genome UNI рекомендован:

Врачам на заметку!
Genome UNI выявит:

Обладает ли тест Genome UNI
доказанной эффективностью?

Для анализа данных используется проприетарный алгоритм и пайплайн, разработанный одной из ведущих компаний США, которая специализируется на анализе данных полного секвенирования генома.

Пайплайн разработан в соответствии с требованиями профессиональной ассоциации медицинских генетиков (ACMG) и ассоциации клинических патологов (CAP) США и включает возможность анализа данных с учетом формализованного описания фенотипа в терминах HPO.

Строгий подход к оценке качества лабораторных данных при использовании профессионального пайплайна позволяет не только повысить выявляемость вариантов, но и избежать ошибок которые могут возникнуть на стадии сиквенса и снизить вероятность ложноположительных результатов.

WGS выявляет больше инсерцционно-
делеционных вариантов при 30х чем WES
при средней глубине 100х

WGS охватывает больше генов на при 30х,
чем WES при 100х

Источник

Как секвенируют ДНК

Секвенирование ДНК в последние десятилетия превратилось из узкой области, которой занималось небольшое число ученых, в одну из самых стремительно развивающихся технологий. Рост производительности и падение стоимости даже опережают закон Мура, и, из-за большой конкуренции на рынке и огромного спроса, развитие и дальше будет идти высокими темпами. Кроме того, развитие секвенирования привело к такому же буму в биоинформатике и коренным образом изменило биологию, и, постепенно, также основательно меняет медицину.

По катом я подробнее рассказываю, как это делают.

Что такое ДНК
Для начала, чтобы понимать сам процесс, немного необходимой теории.
ДНК — это полимерная цепь, состоящая из мономеров четырех типов, называемых нуклеотидами, последовательность которых и кодирует информацию об организме. Иначе говоря, ДНК можно представить как текст, написанный четырехбуквенным алфавитом. ДНК — молекула, состоящая из двух цепочек, и, хотя, последовательность нуклеотидов у них разная, последовательность одной цепочки можно однозначно восстановить, если известна последовательность другой. Поэтому цепочки называют комплементарными. (англ. Complement – дополнение) Это свойство используется при копировании клетки, когда цепочки ДНК расплетаются, и, на каждой, как на матрице, синтезируется вторая, и каждая из двух дочерних клеток получает свою двуцепочечную ДНК. Вся последовательность ДНК организма называется геномом. Например, геном человека состоит из 46 хромосом.

Несмотря на большое количество разнообразных, как экспериментальных, так и устаревших методов, мейнстримовые коммерческие методы довольно похожи, и, чтобы не делать оговорки каждый раз, сразу скажу, что речь дальше будет идти именно об этих мейнстримовых методах.

Как это выглядит в общем
Перед описанием технологии секвенирования, для интуитивного понимания, проведу следующую аналогию: стопку одинаковых газет взрывают так, что они разлетаются на небольшие кусочки с отрывками текста, а, затем, каждый из этих кусочков читают и, из этих прочтений восстанавливают текст первоначальной газеты.

Чтобы секвенировать ДНК, сначала ее выделяют из исследуемого образца, затем режут на небольшие фрагменты случайным образом, фрагменты называются ридами. От каждого рида оставляют по одной цепочке, и на этой цепочке, как на матрице, синтезируют вторую, причем, тип каждого следующего присоединяющегося нуклеотида как-то детектируют. Таким образом, записывая последовательность присоединившихся нуклеотидов, восстанавливают их последовательность в каждом риде. Затем, из последовательностей ридов с помощью компьютерных программ реконструируют геном.

Важный момент. Суммарная длина ридов должна многократно превышать длину исследуемой ДНК. Делается это потому, что, когда ДНК выделяют из образца, и когда ее режут, часть ее теряется, так что никто не гарантирует, что каждый ее участок попадет хотя бы в один рид. Поэтому, чтобы каждый участок гарантированно был бы прочтен, ДНК берут с большим запасом. Кроме того, при секвенировании возможны ошибки, и, чтобы более надежно прочитать ДНК, каждый ее участок следует прочитать несколько раз.

ДНК разрезают на риды, которые читают, и из них восстанавливают первоначальную последовательность

Такая методика используется не от хорошей жизни. Она добавляет множество трудностей, и, если бы исследователи могли взять и прочитать за раз целую последовательность генома, то они были бы счастливы, однако, это на данный момент невозможно.
У этого есть 2 причины. Первая — это ошибки, происходящие при чтении каждого нуклеотида. Они постепенно накапливаются, и, каждый следующий нуклеотид читается хуже предыдущего, и, в какой-то момент качество чтения настолько снижается, что дальше продолжать процесс бессмысленно. У разных методов секвенирования длина рида, которы они могут хорошо прочитать, составляет порядка десятков или сотен нуклеотидов. Вторая заключается в том, что ДНК — это очень длинная молекула, и, при скрупулезном чтении каждой буквы друг за дружкой, секвенирование заняло бы неприлично много времени, а в данном случае этот процесс легко распараллеливается, и можно одновременно читать миллионы и миллиарды ридов.

Illumina
Такая схема в общих чертах описывает все популярные методики секвенирования. Различаются они лишь методами детекции присоединившихся нуклеотидов при синтезе, и методикой подготовки материала.

На сегодняшний день самым распространенным является метод, который используется в секвенаторах компании Illumina. В этом методе сначала множество различных ридов прикрепляется к стеклянной пластине. Затем, с каждого рида делают множество копий на поверхности пластины так, чтобы на каждом ее небольшом участке располагались лишь одинаковые копии. Это делается для того, чтобы при последующем секвенировании получать сигнал не от одиночной молекулы, а от группы одинаковых молекул, располагающихся рядом. Так и сигнал легче считывать, и надежность считывания увеличивается. Эти молекулы являются одноцепочечными ДНК, и на них в процессе секвенирования синтезируются комплементарные цепи. Реакцию синтеза проводят следующим образом: К началу каждой молекулы присоединяется по одному нуклеотиду. Этот нуклеотид химически блокирован так, что после его присоединения синтез дальше не идет. Кроме того, к нему присоединена метка, которая под действием лазера люминесцирует. Причем, для каждого типа нуклеотидов цвет люминесценции разный. После присоединения нуклеотида пластину освещают лазером и фотокамера фиксирует цвета, которыми люминесцирует пластина. После этого блокировку снимают, метку также снимают, и присоединяют таким же образом следующий нуклеотид. Последовательность световых сигналов на каждом участке пластины в компьютере переводится в последовательность нуклеотидов, и, на выходе получается файл, содержащий последовательности ридов.

Секвенирование по методу Illumina
1 — геномная ДНК 2 — разрезается на риды 3 — к ридам прикрепляются адаптеры, с помощью которых они приклеиваются на 4 — пластину 5 — размножение ридов на пластине 6 — засовывам в секвенатор и 7 — секвенируем

Сборка и аннотирование генома
Если геномы близких организмов раньше не секвенировались, то из ридов, затем, с помощью программ, пытаются собрать единую последовательность нуклеотидов. Риды частично перекрываются, и, с помощью этих перекрытий пытаются выстроить единую последовательность. Здесь есть множество моментов, которые существенно осложняют дело. Например, можно загрязнить образец, и программа будет пытаться выстроить одну последовательность из ДНК разных организмов. Секвенатор может ошибиться при чтении рида, или неверно связать два места в геноме, потому что они очень похожи. На самом деле, сложностей так много, что всех тут не перечислишь. И, некоторые из них настолько сложно поддаются устранению, что, даже геном человека, самый важный и широко исследуемый геном, все еще не секвенирован до конца.

риды и внизу последовательность генома, которая реконструирована на их основе

Когда последовательность генома собрана, то нужно понять, что она значит. На ней находят участки, которые похожи на гены. Делается это следующим образом: В начале и конце генов находятся определенные «метки» из нуклеотидов, и, если на ДНК находят такие последовательности на таком растоянии, что между ними может уместиться ген, то такое место заносится в список потенциальных генов. Затем, этого претендента сравнивают с базой данных уже известных генов других организмов, и, если в ней находят ген, достаточно сильно похожий на этот участок, то ему присваивают функцию этого гена.

Если геном другого организма этого вида уже секвенировался, то его используют, для сборки. Так как геномы разных организмов одного вида различаются лишь незначительно, то для каждого рида находят место на секвенированном геноме, к которому он ближе всего, и на основе этого генома собирают новый.

Источник