что такое репликация аденовируса
Что такое репликация аденовируса
Вирусы, лишённые суперкапсида (например, аденовирусы) проникают в клетки путём виропексиса, а имеющие таковой (покс- и герпесвирусы) — за счёт слияния суперкапсида с клеточной мембраной. Репродуктивный цикл ДНК-содержащих вирусов включает раннюю и позднюю стадии (рис. 5-4). У крупных ДНК-вирусов имеется явное несоответствие между кодирующе ёмкостью генома и молекулярной массой вирусиндуцированных белков и белков, входящих состав вирионов. Например, у герпесвирусов лишь 15% ДНК кодирует все белки вирионов и их предшественников. Возможно, значительная часть генома содержит гены, кодирующие синтез ферментов и регуляторных белков. Папова-, адено- и герпесвирусы репродуцируются относительно однотипно, в то время как репродукция поксвирусов имеет некоторые особенности.
Ранняя стадия репродукции. Вирусная ДНК проникает в ядро клетки, где транскрибируется клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразой. При этом считываетеся, а затем транслируется часть вирусного генома («paнние гены»). В результате синтезируются «ранние белки» (регуляторные и матричные белки вирусные полимеразы).
Регуляторные белки выполняют различные функции. При заражении клетки они блокируют синтез клеточных РНК, ДНК и белка и одновременно способствуют экспрессии вирусного генома, изменяя специфичность реагирования клеточных полимераз и полирибосом. Они так же запускают репликацию клеточной ДНК, модифицированной встроенными геномами ДНК содержащих вирусов и ретровирусов, то есть репликацию вирусных геномов. Вирусспецифические полимеразы. В репликацию вирусных геномов также вовлечены вирусоспецифические ДНК-полимеразы, участвующие в образовании молекул ДНК дочерних популяций.
Матричные белки необходимы для репликации нуклеиновых кислот и сборки дочерних популяций. Они образуют электронно-плотные скопления в клетке, известные как тельца включений (например, тельца Гварнери при натуральной оспе).
Поздняя стадия репродукции. На этом этапе происходит синтез нуклеиновых кислот вируса. Не вся вновь синтезированная вирусная ДНК упаковывается в вирионы дочерней популяции. Часть ДНК («поздние гены») используется для синтеза «поздних белков», необходимых для сборки вирионов. Их образование катализируют вирусные и модифицированные клеточные полимеразы.
Паповавирусы и аденовирусы. Репродукция паповавирусов. Репродукция аденовирусов.
Адсорбция, проникновение и депротеинизация аналогичны таковым у РНК-содержащих вирусов, но у папова— и аденовирусов депротеинизация протекает в ядре, а у РНК-вирусов — в цитоплазме.
Ранняя фаза репродукции. Вирусная ДНК («ранние гены») транскрибируется в ядре клетки. На одной из нитей ДНК реализуется транскрипция вирусной «ранней» мРНК. Механизмы транскрипции вирусной ДНК аналогичны считыванию информации с клеточной ДНК. Специфическая мРНК транслируется, начинается синтез ферментов, необходимых для образования дочерних копий ДНК. Синтез клеточной ДНК может временно усиливаться, но затем обязательно подавляется регуляторными белками вируса.
Поздняя фаза репродукции. В течение поздней фазы дочерняя вирусная ДНК продолжает активно транскрибироваться клеточными РНК-полимеразами, в результате чего появляются продукты поздних вирусспецифических синтезов. «Поздняя» мРНК мигрирует в цитоплазму и транслируется на рибосомах. В результате синтезируются капсидные белки дочерней популяции, которые транспортируются в ядро и собираются вокруг молекул дочерней ДНК новых вирусных частиц. Выход полных дочерних популяций сопровождается гибелью клетки.
Что такое репликация аденовируса
Синтез аденовирусной ДНК в ядре клетки происходит приблизительно за 6—7 ч до созревания вирусных частиц. ДНК синтезируется в значительном (примерно десятикратном) избытке по сравнению с количеством, включающимся в вирионы, что вообще характерно для ДНК-вирусов. Синтез длится около 12 ч и приводит к накоплению вирусной ДНК в количестве, примерно равном содержанию ДНК в незараженной клетке. Большой фонд не вошедшей в вирионы ДНК образует часть характерных телец-включений в зараженных аденовирусами клетках. Клеточная ДНК не разрушается и не используется для синтеза вирусной ДНК.
Недавно были проведены работы по исследованию форм реплицирующейся аденовирусной ДНК и структур, в которых осуществляется ее репликация. Показано, что вирусную ДНК можно экстрагировать в виде комплекса с клеточным белком; по-видимому, образование этого комплекса представляет собой одну из стадий репликации (Дёрфлер и др., 1972). На основании характера связи выделенного репликативного комплекса с мембраноподобным материалом было высказано предположение, что вирусная ДНК присоединяется к ядерной мембране, возможно конкурируя с клеточной ДНК за места присоединения (Пирсон и Хэнауолт, 1971).
Несмотря на противоречивость имеющихся данных, кажется вероятным, что аденовирусная ДНК реплицируется в виде линейных молекул размером с геном, причем дочерняя цепь вытесняет родительскую, и образуется структура с одноцепочечной ветвью.
Вновь реплицированную ДНК аденовируса типа 2 можно выделить из ядер зараженных клеток HeLa в виде довольно гомогенного комплекса, имеющего коэффициент седиментации 73S (Уоллес и Кейтс, 1972). Это открывает новые возможности в исследовании связи вирусной ДНК с белком и ранних этапов созревания вирионов.
Сборка и выход аденовируса из клетки
По данным электронной микроскопии, сборка аденовирусов происходит в ядре, которое вирионы покидают лишь при разрушении ядерной мембраны. В ядрах клеток, зараженных аденовирусами, часто видны большие кристаллические скопления вирионов.
Была прослежена судьба индивидуальных полипептидов, представляющих структурные антигены, от момента их синтеза на цитоплазматических полисомах до включения в состав зрелых вирионов (Хорвиц и др., 1969). Синтез и освобождение с рибосом полипептидов гексона занимает 3—4 мин, и еще через 3—4 мин 80—90% гексонов собираются в завершенные капсомеры. Полипептиды основания пентона и нити синтезируются и освобождаются с рибосом еще быстрее (2 мин). Несмотря на то что небольшое количество пентонов образуется из нитей и оснований пентонов довольно быстро, для завершения сборки пентона требуется много часов (Хорвиц и др., 1969), что согласуется с данными, основанными на определении антигенов (Рассел и др., 1967).
Радиоактивные белки сердцевины появляются в вирионах через 15 мин после их синтеза, т. е. раньше, чем в собирающихся вирионах обнаруживаются полипептиды гексона. Синтез индивидуальных полипептидов не координирован со структурными потребностями вируса, и значение перепроизводства пентонов и нитей непонятно; можно лишь предположить, что, будучи наименее многочисленными молекулами капсида, они должны синтезироваться в избытке, чтобы гарантировать адекватный фонд для созревания вирионов.
Для размножения некоторых ДНК-вирусов чрезвычайно важен аргинин; чтобы обеспечить размножение аденовирусов, аргинин должен быть внесен экзогенно (Бонифас, 1967). В отсутствие аргинина образование инфекционного аденовируса типа 2 угнетается, хотя Т-антиген, вирусная ДНК, гексон, основание пентона и нить синтезируются. При внесении аргинина в среду на поздних сроках инфекции новый инфекционный вирус удается обнаружить очень быстро. Это позволяет экспериментально изучать некоторые стадии сборки вируса, однако, поскольку стандартизовать условия довольно трудно, результаты, полученные в различных лабораториях, не совпадают.
Было высказано предположение, что из-за недостатка аргинина тормозится какой-либо поздний этап размножения, например синтез фактора созревания, и что этот фактор, возможно, является компонентом сердцевины зрелого вириона, богатым аргинином (Рассел и Бекер, 1968). В настоящее время накоплены данные по синтезу белков в условиях голодания по аргинину (Arg) (Рауз и Шлезингер, 1972; Рашка и др., 1972). Все основные вирусные структурные полипептиды в этих условиях образуются, но в меньших количествах. Крайне удивительно, что эти белки не используются для сборки вириона при восстановлении уровня аргинина; Эверитт и др. (1971) обнаружили, что титры капсидных антигенов, в частности антигена гексона, при этих условиях значительно уменьшались, в то время как титры антигенов основания пентона и нити уменьшались совсем немного. Количество некоторых вирус-специфических антигенов, например Р-антигена, по данным иммунофлуоресценции, но не реакции связывания комплемента, снижалось (Рассел и Бекер, 1968). Возможно, вирусные структурные антигены, синтезированные в условиях голодания по аргинину, не способны мигрировать из цитоплазмы в ядро, как это найдено в зараженных вирусом герпеса клетках, лишенных аргинина, однако точных данных по этому вопросу пока не получено.
Количество аденовирусной ДНК, а также синтез вирус-специфических РНК в отсутствие аргинина уменьшаются примерно в 10 раз. Последовательности РНК, синтезированные в зараженных клетках в присутствии и в отсутствие аргинина, существенно не различаются. Зависящий от аргинина этап следует за синтезом ДНК, так как при продолжительном подавлении синтеза вирусной ДНК в присутствии аргинина инфекционный вирус не образуется при снятии блока в отсутствие аргинина. В общем эти данные свидетельствуют о том, что существует некий фактор «созревания», строго зависящий от вносимого извне аргинина.
Замечено, что синтез сердцевинного полипептида 2, богатого аргинином компонента, в отсутствие аргинина подавлен, и, возможно, именно этот полипептид контролирует скорость репликации вирусной ДНК, а также сборку вирусной ДНК и белков в нуклеокапсиды (Рассел и Скехел, 1972).
Более полное понимание механизмов сборки и созревания аденовирусов дают исследования, подобные работе Уинтерса и Рассела (1971), которым удалось показать сборку инфекционного аденовируса in vitro в экстрактах из зараженных клеток. Поскольку в настоящее время существуют методы выделения внутреннего вирусного нуклеопротеида, содержащего только один чрезвычайно богатый аргинином белок, связанный с вирусной ДНК, можно прямо проверить роль богатого аргинином белка в сборке. Однако вполне возможно, что в сборке участвует не только один фактор созревания; Уинтерс и Рассел обращают внимание на тот факт, что в неочищенных экстрактах определенное значение могут иметь липидсодержащие мембраны, так как неионные детергенты и фреон угнетают этот процесс.
Крохотные курьеры: как аденоассоциированные вирусы спасают жизни
Крохотные курьеры: как аденоассоциированные вирусы спасают жизни
Авторы
Редакторы
Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021
Эта работа опубликована в номинации «Вирусы и микроорганизмы» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.
Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.
Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.
Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Введение
Эта история началась в середине 1960-х, когда в препаратах аденовируса обезьян случайно было обнаружено загрязнение из маленьких неизвестных частиц [1]. Эти частицы были впоследствии названы аденоассоциированным вирусом (сокращенно ААВ, англ. adeno-associated virus, AAV). Тогда мало кто мог предположить, что именно эти крошечные вирусы дадут надежду многим неизлечимым больным. И лишь несколько исследовательских групп, движимых чисто научным любопытством, отправились изучать базовую биологию ААВ.
Прошло несколько десятков лет, и стало понятно, что ААВ обладает множеством уникальных свойств. Эти особенности позволяют использовать его в поистине революционном направлении — генной терапии. По разным оценкам, около 5% новорожденных детей страдает от различных генетических заболеваний [2]. Долгие годы такие болезни считались неизлечимыми, и для многих подобный диагноз приравнивался к приговору. К счастью, времена изменились. Мы находимся на пороге эры лекарств принципиально нового типа [3], и немаловажную роль в этом сыграл аденоассоциированный вирус [4].
Биология вируса
Какими же уникальными особенностями обладает ААВ? Чтобы ответить на этот вопрос, нужно подробнее поговорить про его жизненный цикл и строение.
Аденоассоциированный вирус принадлежит к роду Dependoparvovirus семейства Parvoviridae. Название рода отражает его необычный жизненный цикл, когда для размножения необходимо наличие вспомогательного вируса (от лат. Dependo — «зависеть»). В качестве такого вируса-помощника, как правило, выступает аденовирус (что явно следует из названия) или представители семейства герпесвирусов [5].
ААВ настолько безобиден, что помимо неспособности самостоятельно размножаться, он не вызывает никаких заболеваний человека и животных. Более того, согласно некоторым исследованиям, большинство людей (>70%) в течение жизни были заражены одним или несколькими серотипами ААВ [6]. (Серотип — вариант вируса, который отличается от других антигенами на своей белковой оболочке).
Вирус довольно мал — его икосаэдрическая белковая оболочка (капсид) в диаметре составляет всего около 25 нм (риc. 1а). Капсид необычайно стабилен: устойчив к кратковременному воздействию тепла, кислой среде и протеазам [7]. Геном, представленный одноцепочечной ДНК, по размерам также весьма скромен — всего 4,7 тысяч нуклеотидов [7].
Этот небольшой геном содержит минимальное количество генов. Ген rep (от слова replication) кодирует белки, необходимые для размножения вируса и его дальнейшей сборки внутри клетки (рис. 1б). Ген cap (от слова capsid) кодирует белки капсида (рис. 1б).
Геном ААВ обрамлен двумя Т-образными шпильками — инвертированными концевыми повторами (inverted terminal repeats, ITR) (рис. 1б).
Рисунок 1. Аденоассоциированный вирус. а — Модель капсида ААВ. б — Геном аденоассоциированного вируса. ITR (inverted terminal repeats) — инвертированные концевые повторы, образующие Т-образные шпильки; rep — ген, кодирующий белки, отвечающие за репликацию; cap — ген, кодирующий белки капсида.
Судьба вируса в клетке
Ценное свойство ААВ — его способность проникать как в делящиеся, так и неделящиеся клетки [8]. На первом этапе аденоассоциированный вирус связывается с рецептором на поверхности клетки (рис. 2) [9]. Разные серотипы ААВ предпочтительно связываются со своими рецепторами, характерными для определенных типов клеток [10].
Рисунок 2. Проникновение ААВ внутрь клетки. Пояснения в тексте.
[9], рисунок с изменениями
И это важное свойство — определенный серотип преимущественно проникает лишь в конкретную ткань или орган, то есть обладает своим уникальным тропизмом.
Связывание вируса с рецептором запускает процесс проникновения внутрь клетки. Эндосома (мембранный пузырек, содержащий вирусную частицу) передвигается в цитоплазме по цитоскелету. Постепенно среда в эндосоме закисляется, что приводит к изменениям капсида, необходимым для дальнейшего успешного заражения клетки. После выхода из эндосомы у вируса два пути. Либо он попадает в клеточную машину по уничтожению белков (протеасому) и разрушается, либо переносится в ядро, где вирусный геном высвобождается из капсида (рис. 2) [10].
С одноцепочечного вирусного генома еще не могут нарабатываться белки, для этого необходимо достроить вторую цепь ДНК. Она синтезируется с помощью ДНК-полимеразы клетки-хозяина, используя шпильку ITR в качестве затравки для построения второй цепи.
Вирусные ITR помогают не только строить вторую цепь ДНК, но способствуют межмолекулярной и внутримолекулярной рекомбинации геномов вируса. В результате в ядре клетки образуются кольцевые молекулы ДНК — эписомы (рис. 2). В такой форме геномы ААВ могут в течение многих лет присутствовать в ядре [10].
Кроме того, геном ААВ может с низкой частотой встраиваться в определенный локус на 19 хромосоме человека [11]. Этот феномен обусловлен сходством последовательностей ДНК данного локуса и ITR вируса. У ААВ, лишенного гена rep, способность к встраиванию своего генома сильно снижена. Такие вирусные геномы присутствуют в клетках в виде эписом.
Модификация ААВ для применения в генной терапии
Если в гене человека произошла мутация, которая привела к развитию заболевания, то болезнь можно победить или облегчить, если доставить в клетки организма рабочую копию поломанного гена. Вот тут и выходит на сцену аденоассоциированный вирус.
Что же нужно было в нем изменить, чтобы он стал курьером для доставки таких терапевтических генов? Как это часто бывает в биологии, ученые просто воспользовались успешными решениями, уже созданными природой. Раз капсид ААВ сам по себе является ключом к входу в клетку и ядро, то можно смело этим воспользоваться. Остается только заменить гены самого вируса на гены, интересующие исследователя, и вирусный курьер готов!
Модификация генома ААВ
Оказалось, что от всего генома ААВ необходимо было оставить только концевые шпильки ITR, необходимые для сборки самого вируса и сохранения его генома в ядре (рис. 3) [12]. Таким образом, можно без последствий удалить до 96% генома ААВ, используя полученное пространство для кодирования нужных генов.
Так как ААВ вмещает в себя всего около 5000 пар нуклеотидов, то нужно очень тщательно продумать остальной состав кассеты. В первую очередь туда необходимо поместить рабочую копию гена (трансген), в зависимости от того генетического заболевания, на которое направлено лечение. Также обязательно наличие регуляторных последовательностей, таких как промотор и сигнал полиаденилирования (рис. 3). Разберем элементы кассеты подробнее.
Рисунок 3. Компоненты типичной кассеты ААВ вектора. Оранжевые блоки (промотор, трансген и сигнал полиаденилирования — рА) являются обязательными компонентами. Для повышения эффективности экспрессии могут быть включены необязательные регуляторные элементы, такие как интрон (I) и другие компоненты 3′-нетранслируемой области (НТО). Кассета обрамлена инвертированными терминальными повторами (ITR).
рисунок авторов статьи
Из-за ограниченной емкости вируса могут возникнуть трудности с доставкой больших терапевтических генов. Очевидное решение проблемы — разработка сокращенной версии гена, который кодирует усеченный, но функциональный белок. Создание таких укороченных генов требует глубокого понимания биологии терапевтического белка, взаимосвязи его структуры и функции. Такой подход уже успешно применяется в нескольких клинических испытаниях по лечению миодистрофии Дюшенна [13] (ссылки на клинические испытания: NCT03368742, NCT04281485, NCT03769116), в доклинических исследованиях по лечению дисферлинопатии, амавроза Лебера и многих других заболеваний.
Другим потенциально перспективным подходом для доставки слишком больших трансгенов может быть разделение гена между двумя ААВ-векторами [14]. Два этих векторных генома, попадая в одно и то же ядро клетки, могут подвергаться межмолекулярной рекомбинации с последующим восстановлением полноразмерного гена. Такой двухвекторный подход пока применяется лишь в редких клинических испытаниях (пример — NCT02710500). Низкая эффективность восстановления полноразмерного гена ограничивает более широкое применение этого приема.
Правильно выбранный промотор — во многом залог успешной генной терапии. Идеальный промотор должен запускать стабильную высокую экспрессию трансгена в пораженных органах в течение длительного периода, при этом быть неактивным в других тканях. Малая емкость ААВ также требует уменьшения размера промотора [15].
К кассету можно добавить необязательные элементы, способные улучшить экспрессию трансгена (рис. 3). Так, например, присутствие интрона повышает стабильность РНК в ядре [16], а также способствует эффективному транспорту мРНК из ядра в цитоплазму [17].
К обеспечению тканеспецифичности можно подойти с другой стороны — не только стимулируя экспрессию в целевых тканях, но и подавляя ее в нежелательных органах с помощью механизмов РНК-интерференции [18]. Для этого в 3′-НТО-кассеты добавляют сайты связывания микроРНК, присутствующих строго в нецелевых органах (рис. 3) [19]. Если трансген оказывается в нежелательном органе, то микроРНК связывается с комплементарными ей сайтами в транскрипте и запускает его деградацию.
Модификация капсида ААВ
Хотя капсид ААВ — сам по себе уже удачное изобретение природы, человечество не остановилось в своем научном поиске. Новые серотипы ААВ могут обладать рядом преимуществ:
Благодаря развитию новых методов анализа выделяют несколько основных направлений для создания или выявления новых серотипов.
К сожалению, всегда существует вероятность, что хорошо работающий in vitro модифицированный капсид в экспериментах на лабораторных животных продемонстрирует низкую эффективность или даже токсичность. Всестороннее изучение свойств разрабатываемых препаратов и строгий контроль качества призваны минимизировать риск неблагоприятного исхода исследований [23].
Применение ААВ в клинике
Целевые органы, на которые направлена терапия
К 14 декабря 2020 года 227 препаратов на основе ААВ проходят клинические испытания (по данным сайта ClinicalTrials.gov). Сегодня уже существует несколько препаратов на основе ААВ, которые получили одобрение от регулирующих органов для коммерческого использования у пациентов (подробнее про эти препараты можно почитать в [4]):
Большинство серотипов ААВ «предпочитают» проникать в такие органы, как печень, поперечно-полосатые мышцы и ЦНС, что и определило направление большинства программ генной терапии (рис. 4).
Рисунок 4. Данные с сайта ClinicalTrials.gov: на 13 ноября 2018 г. было зарегистрировано 145 клинических испытаний с использованием ААВ. а — Классифицикация клинических испытаний на основе примененного серотипа ААВ (AAV). б — Целевой орган, на который направлена терапия в указанных клинических испытаниях. Можно заметить, что спустя два года количество клинических испытаний с применением ААВ почти удвоилось (227 на сегодняшний день против 145 испытаний два года назад).
Почти все природные серотипы ААВ эффективно заражают печень после внутривенного введения. Благодаря данному свойству вируса в клинических испытаниях находятся препараты для лечения гемофилии A и B (NCT03392974, NCT03587116), семейной гиперхолестеринемии (NCT02651675), дефицита орнитинтранскарбамилазы (NCT02991144), мукополисахаридоза-IIIA (NCT03612869) и синдрома Криглера—Найяра (NCT03223194) [25].
Серотипы ААВ8 и ААВ9 могут эффективно заражать разные типы мышц по всему телу. Такое свойство делает их идеальными векторами для генной терапии множества мышечных заболеваний [26]. Так, активно исследуются в клинике препараты для лечения миодистрофии Дюшенна (NCT03375164), дисферлинопатии (NCT02710500), миотубулярной миопатии (NCT03199469), болезни Помпе (NCT03533673). Примечательно, что зараженная мышца может также служить биофабрикой для производства секретирующихся терапевтических белков для лечения немышечных заболеваний. Хотя большинство сердечных заболеваний полигенны и подвержены влиянию окружающей среды, ведется разработка препаратов генной терапии для лечения сердечной недостаточности [26].
Большой процент разрабатываемых препаратов на основе ААВ направлен на лечение неврологических и глазных болезней (рис. 4) [27], [28]. Глаз — весьма обособленный орган, обладающий уникальной иммунологической толерантностью, и легко доступный для прямого введения препарата. Нетрудно понять, почему один из первых одобренных препаратов, «Люкстурна», был направлен именно на лечение наследственной слепоты. Мозг, напротив, намного более крупный и сложно организованный орган. Прямая доставка препарата в мозг или спинномозговую жидкость позволяет локализовать вирус и снизить дозу препарата, но это инвазивная процедура, сопряженная со многими рисками. К счастью, такие серотипы, как ААВ9 или ААВrh.10, могут пересекать гематоэнцефалический барьер, что позволяет использовать рутинное внутривенное введение. В настоящий момент в клинических испытаниях уже находятся препараты для лечения болезни Паркинсона (NCT02418598), метахроматической лейкодистрофии (NCT01801709), болезни Баттена (NCT01414985), мукополисахаридоза 3 типа (NCT03300453).
Основные стратегии генной терапии на основе рААВ
Можно выделить 4 глобальных направления генной терапии с применением ААВ (рис. 5).
Рисунок 5. Основные стратегии генной терапии на основе ААВ. Пояснения в тексте.
[29], рисунок с изменениями
Производство ААВ
Когда речь идет о клинических испытаниях, требуется очень большое количество вирусного препарата высокого качества. Его производство — весьма нетривиальная задача.
Вирусы не могут самостоятельно себя воспроизводить, им необходима помощь клеточной машинерии. Для наработки ААВ стали использовать культуры клеток. Вариантов может быть много: использование культуры дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) [33], клеток насекомых (культура клеток Sf9 бабочки Spodoptera frugiperda) [34], человека — HEK293, HeLa. Некоторые из этих подходов, — скорее, экзотика, но использование культур клеток млекопитающих (HEK293) или насекомых (Sf9) уже прочно закрепилось на производстве.
Итак, для начала необходимо определиться с методикой производства, ведь от этого зависит, в чем будет расти сама культура. Вариантов масса: для клеток, растущих, прикрепившись к субстрату, это могут быть большие чашки Петри, специальные сосуды с множеством перегородок для увеличения площади поверхности (рис. 6а). Для культур, хорошо чувствующих себя в виде суспензии и при постоянном перемешивании, — колбы, герметичные пакеты и многое другое. При увеличении масштабов производства можно переходить на специальные биореакторы (рис. 6б). С их помощью можно следить за целой панелью важных для процесса параметров. Они делают производство более технологичным и позволяют увеличить объемы продукции до нескольких сотен литров вирус-содержащей суспензии за один цикл работы.
Рисунок 6. Производство ААВ: на культуральных чашках (а) и в биореакторе iCellis Nano (Pall corporation) (б)
фотографии авторов статьи
Что нужно сделать с культурой клеток, чтобы она стала биофабрикой по производству вирусных частиц? В такие клетки-производители вносят плазмидную ДНК, кодирующую необходимую для сборки вирусов информацию. Наиболее популярный протокол предполагает одновременное заражение клеток тремя плазмидами (рис. 7):
Кстати, вместо третьей плазмиды может быть добавлен сам вирус-помощник (аденовирус или герпесвирус), как это было в более ранних протоколах по производству частиц ААВ [35].
Рисунок 7. Производство ААВ, использующее в качестве клеток-производителей культуру клеток человека HEK293. Смесь трех плазмид доставляют внутрь клетки (плазмиду с терапевтическим геном, плазмиду, кодирующая гены rep/cap, и плазмиду с генами вируса помощника). Начинается наработка необходимых белков для сборки вирусных частиц. ДНК, содержащая терапевтический ген, упаковывается в готовый капсид ААВ.
Клетки начинают производить вирусные частицы, после чего их надо собрать и очистить.
Это критически важный этап, которому стоит уделить особое внимание [22], [23]. Любые примеси, которые будут содержаться в препарате, могут вызвать нежелательный иммунный ответ.
Вначале собирают сырой материал: это может быть клеточная среда, если вирусы выделяются клетками преимущественно в жидкость вокруг, а могут быть и сами клетки, если большинство вирусных частиц накапливается внутри. Как правило, это зависит от конкретного серотипа ААВ. Чтобы разрушить клеточные мембраны и высвободить вирус, клетки подвергают многочисленным циклам замораживания-оттаивания, ультразвуковой обработке или воздействию детергентов.
Теперь основная задача — очистить вирусные частицы от многочисленных примесей, находящихся в суспензии (рис. 8). В сыром материале находятся внутриклеточные свободные ДНК и РНК, белки и ферменты, крупные обломки клеточных мембран и многое другое. Способов очистки существует множество, и постоянно появляются как улучшенные версии уже применяемых методик, так и принципиально новые подходы. Все они различаются по уровням специфичности, эффективности и, разумеется, стоимости. Условно способы очистки можно разделить на серотип-специфичные и универсальные. К первой категории относится, например, аффинная хроматография [37], основанная на специфическом узнавании капсидов антителами. Ко второй — ультрацентрифугирование в градиентах плотности растворов йодиксанола или хлорида цезия, преципитация полиэтиленгликолем или сульфатом аммония, ионообменная хроматография и многие другие методы, основанные на общих физических свойствах вирусных частиц [38].
Рисунок 8. Окрашивание серебром очищенного (лунки 1–3) и загрязненного другими белками (лунки 4–8) препарата ААВ после гель-электрофореза [38].
Одна из неочевидных нежелательных примесей — так называемые пустые капсиды — вирусные частицы, не несущие в себе терапевтический ген, или содержащие внутри себя постороннюю ДНК. Дело в том, что изначально в клетке формируется пул пустых капсидов. Лишь потом ДНК связывается с пустым капсидом при помощи специальных сигналов на ITR и компактно упаковывается, формируя полноценную вирусную частицу. Но иногда пустой капсид может так и остаться пустым при нехватке вирусной ДНК или ее неэффективной упаковке. В пустой капсид может также упаковаться обрывок свободной ДНК, находящейся в клетке и содержащей последовательность, схожую с сигналом упаковки. Такие частицы (совсем пустые или несущие неправильную последовательность) не функциональны и подлежат удалению из очищаемого препарата. С определенной эффективностью их можно отделить от функциональных капсидов, используя градиенты плотности или методы хроматографии.
Основные проблемы
Наработка большого количества плазмид высокой степени очистки, поддержание культур клеток, дорогостоящие реактивы, сложный процесс очистки вирусных частиц и разработка аналитических методик для характеризации препаратов ведут к таким космическим ценам при масштабировании производства. На стоимость также влияет серьезный контроль качества вирусного препарата. Чтобы препарат вышел на рынок, проводятся исследования его токсичности, безопасности, биораспределения, эффективности. Оценивается содержание белковых примесей, бактериальных эндотоксинов, количество пустых капсидов, стерильность препарата, концентрация вирусных частиц в растворе и множество других характеристик [23]. В настоящий момент гиганты производств ААВ по всему миру работают над удешевлением препаратов, разрабатывая более эффективные протоколы сборки и очистки ААВ.
Иммунный ответ также представляет собой серьезную проблему. Потенциально иммунные реакции могут возникать на вирусный капсид, его геном, а также на белковый продукт трансгена. Препаратам на основе ААВ могут помешать нейтрализующие антитела к его капсиду [39]. Связываясь с вирусами в кровотоке, антитела препятствуют проникновению вирусных частиц в клетки, что ведет к низкой эффективности препарата. В настоящий момент обязательно проводится скрининг пациентов на наличие антител к применяемому серотипу ААВ [40]. В случае их обнаружения такой пациент исключается из клинических испытаний. Ведется разработка новых капсидов, которые не будут узнаваться нейтрализующими антителами [41]. После доставки терапевтических доз ААВ быстро развивается гуморальный иммунный ответ, который впоследствии помешает повторному введению препарата [42]. Именно поэтому большинство генотерапевтических препаратов на основе ААВ рассчитано на однократное введение. Для подавления Т-клеточного иммунного ответа у пациентов применяется фармакологическая супрессия стероидами [40].
Заключение
Генная терапия на основе ААВ — бурно развивающееся направление, и мы в данном обзоре затронули лишь небольшой кусочек этой удивительной области. Текущий экспоненциальный рост клинических испытаний с использованием ААВ предполагает, что мы находимся в самом начале эры новых генотерапевтических препаратов. Еще очень много задач предстоит решить, и для этого требуются мультидисциплинарные усилия. Дальнейшее развитие молекулярной биологии, биоинформатики, эпидемиологии, структурной биологии, иммунологии, геномики и других дисциплин, безусловно, будет способствовать совершенствованию технологии. Уже пройден длинный путь в попытке человечества победить генетические заболевания. Мы надеемся, что именно генная терапия приведет к окончательной победе!